Аллелоспецифическая гибридизация олигонуклеотидов

Аллелоспецифическая гибридизация олигонуклеотидов * алеласпецыфічная гібрыдызацыя алігануклеатыдаў * allelespecific oligonucleotide hybridization or ASo — фрагменты ДНК, амплифицированные с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы ДНК обследуемых индивидуумов и ДНК дикого типа, денатурируют и иммобилизируют на нитроцеллюлозных и нейлоновых мембранах. Мембрану со специфически связанными с ней нуклеиновыми кислотами обычно называют блотом. В том случае, если ДНК наносят на мембрану в виде круглых пятен с помощью микропипетки, речь идет о дот-блотах. Один из дот-блотов гибридизируют с олигонуклеотидом (обычно с меченным 32Р или флуоресцентной меткой), первичная структура которого соответствует исследуемому аллелю дикого типа (дот-блот-гибридизация). Другой дот-блот гибридизируют с меченым олигонуклеотидом, соответствующим мутантному аллелю. Температуры плавления образовавшихся гетеродуплексов и правильных гибридов различаются. Поскольку в гетеродуплексах имеется ошибочно спаренный нуклеотид, то температура их плавления (денатурации) будет ниже, чем у соответствующих правильных гибридов. Подобрав температуру, при которой происходит плавление гетеродуплексов, а не правильных гибридов, можно путем промывки буфером определенной температуры избирательно убрать с дот-блотов меченые олигонуклеотиды гетеродуплексов, сохранив олигонуклеотиды правильных гибридов в связанном с ДНК дот-блотом состоянии. После авторадиографии дот-блот-гибридов, промытых буфером со ответствующей температуры, получается следующее: 1) в случае гибридизации ДНК дот-блотов с олигонуклеотидным зондом, соответствующим последовательности нуклеотидов нормального аллеля, гибрид сохраняется, если в пятне присутствует ДНК дикого типа здорового индивидуума, однако гибрид разрушается, если в доте присутствует ДНК особи с мутантным геном в гомозиготном состоянии (оба аллеля исследуемого гена, полученного от каждого из родителей, мутанты). В этом случае в результате гибридизации зонда с ДНК обоих аллелей образуются гетеродуплексы, содержащие ошибочно спаренный нуклеотид с пониженной температурой плавления; 2) в том случае, если индивидуум гетерозиготен по исследуемому гену и его ДНК включает в себя как мутатный, так и аллель дикого типа, в результате промывки гибрид мутантного аллеля разрушается, а дикого типа и, соответственно, половина образованных гибридов — сохраняется. При использовании в дот-блотгибридизации олигонуклеотидного зонда, соответствующего мутантному аллелю, по тем же самым причинам после промывки в жестких температурных условиях гибриды сохраняются в случае ДНК гомозиготных и гетерозиготных по мутантному аллелю индивидуумов, но будут разрушены в пробах с ДНК, содержащей только нормальные аллели.